Metagenomika a bioinformatika jako východisko pro přípravu efektivních postupů, přípravu a charakterizaci mikroorganismů a jejich konsorcií pro využití v bioremediaci
Soutěž: NÁRODNÍ PROGRAM VÝZKUMU II - Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy [VSMSMT8NPV2]
Program: ZDRAVÝ A KVALITNÍ ŽIVOT [2B]
Tematická oblast programu: Bioremediace životního prostředí pomocí mikroorganismů [2B-3-2]
Téma projektu: Nové postupy umožňující využití genetického inženýrství s cílem získat organismy schopné degradovat kontaminanty půdy nebo vody [2B-3-2-2]
Tento projekt bude zaměřen na studium genetické a následně i metabolické biodiverzity mikroorganismů přítomných ve znečištěných lokalitách a na identifikaci a cíleném využití biochemických drah, enzymů a genů, podmiňujících požadované vlastnosti, které lze využít pro degradaci a odstraňování znečišťujících látek ze životního prostředí.
Projekt poskytne inovační nástroj pro řízení bioremediačních procesů v závislosti na změnách katabolické aktivity a mikrobiálních populací vyvolaných změnami podmínek prostředí v průběhu čištění kontaminovaných matric. Tento výstup je zcela unikátní a doposud nebyl nikde použit.
Mikroorganismy představují skupinu organismů, která je zapojena do koloběhu všech základních prvků nezbytných pro existenci vyšších forem života a představují počátek pro přeměnu řady látek, které tak vstupují do potravního řetězce živočichů a nakonec i člověka. Vedle běžně známých nepathogenních i pathogenních mikroorganismů, mají některé mikroorganismy unikátní vlastnosti, které spočívají v asimilaci neobvyklých substrátů, schopnosti přežívat v extrémních podmínkách, nebo schopnosti degradovat toxické látky, vyskytující se v přírodě.
S rozvojem řady odvětví průmyslu a zemědělství prospěšných pro lidskou populaci dochází i k negativním jevům, jako je nadbytečné uvolňování některých látek, toxických a potenciálně toxických, do prostředí. Zvyšující se znečištění vody a půdy xenobiotiky vytváří primární potřebu pochopit dopad tohoto znečištění na mikrobiální populace a na katabolické degradační pochody probíhající uvnitř mikrobiálního prostředí. Mikroorganismy, a z tohoto hlediska především bakterie, jsou vysoce adaptabilní organismy schopné přizpůsobit svůj metabolismus podmínkám a selekčnímu tlaku daného prostředí v relativně velmi krátké době. Pochopení těchto katabolických procesů pak může vést k jejich využití pro zvýšení efektivity biotechnologických a bioremediačních postupů.
Nedávné pokroky v molekulárně biologických technikách, jako je využití mikročipů a metagenomické přístupy (charakterizace mikroorganismů bez potřeby kultivace, metagenomická sekvenční analýza), schopné rychle analysovat a poskytovat ohromné množství dat, otevírají nové perspektivy a naznačují možnosti k efektivním způsobům odstraňování znečištění v daných lokalitách a k celkovému přístupu v ochraně životního prostředí. Ve srovnání s tradičními technologiemi závislými na isolaci jednotlivých bakteriálních kmenů v laboratoři, umožňuje metagenomický přístup odpovědi na důležité enviromentální otázky zaměřené především na specifické vlastnosti půdních mikroorganismů, které nelze pěstovat v laboratorních podmínkách a které nebyly z tohoto důvodu zatím objeveny ani charakterizovány.
Xenobiotika jsou definována jako sloučeniny, které jsou cizí pro živé organismy a v přírodě se vyskytují jako důsledek lidské činnosti. Tyto látky buď nejsou nebo jsou velmi omezeně degradovatelné známými enzymy vyšších organismů a velmi často mají tendenci se akumulovat ve vodách a dnových sedimentech, v půdě, rostlinách a následně i tkáních živočichů. Polyaromatické, halogenované a nitroaromatické sloučeniny jsou pro živé organismy toxické. Jenom mikroorganismy jsou v přirozených biogeochemických cyklech vzhledem ke své vnitřní adaptabilitě schopné rozložit, nebo dokonce zužitkovat tyto jinak toxické látky ve svůj prospěch. Jeden z důvodů, proč jsou naše současné znalosti mikrobiálních degradativních pochodů poměrně mizivé, souvisí s možností izolovat a kultivovat právě jen velmi malý zlomek mikrobiální půdní populace (uvádí se, že maximálně 1 až 10 % populace představuje kultivovatelnou část). I když se budou kultivační podmínky pro dosud neznámé půdní mikroorganismy nadále vyvíjet a rozšiřovat, naše neznalost metabolických pochodů v přirozeném půdním prostředí, vzájemné interakce a změny biodiversity a schopnost taxonomicky charakterizovat mikrobiální populace, se tím nezmění. Totéž platí i pro následné postupy užívané k charakterizaci a identifikaci (imunochemické a biochemické testy). V takových komplexních biologických systémech jaký představuje půda, dnové sedimenty a vodní prostředí se vyskytuje až 10 na desátou mikrobiálních buňek a až tisíce taxonomicky různých druhů mikroorganismů v jednom gramu nebo mililitru matrice vzorku. Většina přítomných mikroorganismů může být těžko kultivovatelná mimo přirozené prostředí, neboť nejsou přítomny symbiotické organismy (například rostliny v případě rhizosféry), není dostatek správných živin, neodpovídá teplota nebo jiné podmínky.
Většina dosavadních metod zaměřených na popis půdní biodiverzity je založena na kultivaci mikrobiálních konsorcií, isolaci jednotlivých zástupců a následné charakterisaci metodou polymerasové řetězové reakce (PCR) s využitím specifických primerů, následné analýze genu 16S rRNA nebo využití metod RFLP (random fragment lenght polymorphism) TTGE (temporary temperature gel electrophoresis), DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis), SIP (stable isotope probing) nebo na fingerprintových metodách. Zdokonalení a rozšíření možností analysy představuje využití metod vedoucích k přímé isolaci celkové DNA z daného materiálu (půda, dnové sedimenty, voda atd.) a amplifikaci požadovaných fragmentů, bez potřeby kultivace jednotlivých mikrobiálních druhů. Tento přístup představuje zdokonalení, avšak neumožňuje zachytit na jedné straně taxonomickou, genetickou a metabolickou diversitu, na druhé straně charakterisovat komplexnost systému vedoucí k udržení rovnováhy v daném prostředí.
Novým metodickým základem pro komplexní přístup, pochopení funkce biologického systému jeho fysiologie a ekologie se stává rychle se rozvíjející obor metagenomiky, zvláště pak v souvislosti s novým progresivním způsobem genomového sekvenování DNA. Ty vedou k zavedení přístupů založených buď na tzv. sekvenčním klonování s využitím detekce určitého fylogenetického znaku, typického pro určitý taxon, nebo na tzv. náhodné sekvenační analyse. Tento přístup je základem pro získání informací o diversitě, distribuci funkcí dané komunity, vzájemných interakcích a komunikaci, organizaci genomů a také horizontálním přenosu genů.
Pro nový obor metagenomiky je studovaným živým materiálem nikoliv jeden nebo několik příbuzných druhů organismů, ale vzorek prostředí, který obsahuje tisíce z kvantitativního hlediska různě zastoupených organismů, většinou mikrobiální povahy. Tento vzorek prostředí navíc metagenomika studuje z komplexního pohledu, tedy tak, že jej vnímá právě jako by to byl jeden organismus, jehož jednotlivé složky, na genetické úrovni jsou to genomy, se navzájem ovlivňují a doplňují. Z metodického pohledu je metagenomika závislá na masivní produkci genetických a sekvenčních dat a na jejich bioinformatickém zpracování.
Genomový sekvenátor GS FLX (Roche Diagnostics), který je od letošního roku na trhu, je schopen metodou paralelních pyrosekvenčních reakcí z jednoduše připravené knihovny náhodných fragmentů DNA (protokol vyžaduje několik málo kroků dokončených během jednoho dne) vygenerovat během 8 hodin přes 100 Mb sekvenčních dat. Sekvence každého z více než 400 tisíc fragmentů je v průměru dlouhá 250 bazí. Na rok 2008 je firmou Roche ohlášena verze genomového sekvenátoru s ještě vyšší kapacitou produkce sekvenčních dat (500 Mb, 1 milion současně čtených fragmentů DNA, průměr 500 bazí na jeden fragment). Zásadní přednosti proti dosavadním možnostem v oblasti masivní produkce sekvenčních dat tkví ve třech aspektech. Za prvé, není nutné molekulární klonování fragmentů DNA do vektorů, ani robotická izolace těchto klonů, ani stovky po sobě následujících kapilárních elektroforéz. Za druhé, celý proces generování 100 Mb, resp. 500 Mb trvá dva dny a je proveditelný v jedné laboratoři. Za třetí, náklady na produkci jednoho čtení, 250 bazí, resp. 500 bazí se pohybují kolem 1 Kč, tedy více než o dva řády méně, než jsou náklady na tradiční Sangerovu analýzu na běžném kapilárním sekvenátoru.
Nedílnou součástí přístupů založených na analyse genetických vlastností je v dnešní době bioinformatika. Její dostupnost je vzhledem k množství generovaných a zpracovávaných dat dnes nezbytným předpokladem většiny úspěšné experimentální práce. Databáze nukleotidových a aminokyselinových sekvencí jsou v současné době východiskem pro jakýkoliv vědecký projekt, který se zabývá environmentální a populační genomikou mikroorganismů.
Jedno z navrhovaných řešitelských pracovišť, Oddělení genomiky a bioinformatiky na Ústavu molekulární genetiky AV ČR, v.v.i., se dlouhodobě věnuje studiu genomů, vyvíjí a používá bioinformatické nástroje jako jsou specializované databáze a výkonný software pro analýzu genomových sekvencí. Posledním genomovým projektem je v letošním roce dokončená sekvenace a analýza genomu chemolithotrofní fotosyntetizující bakterie Rhodobacter capsulatus.
Pro efektivní využití mikroorganismů k bioremediaci znečištených lokalit je třeba mít komplexní zdroj genetických informací, z kterého se bude čerpat a který umožní navazující biotechnologické kroky. Ty budou zahrnovat např. analysu symbiotických vztahů s dalšími organismy (mikroorganismy, rostliny), testování výživových nároků a schopnosti kolonizace ve spojení s rhizosférou rostlin, sledování průběhu bioremediace po změně konsorcia například po zpětném navrácení přirozených degradérů do kontaminovaného prostředí a jejich cílenou podporu ve výživových nárocích, a obdobně v případě modifikovaných organismů. Vnesené organismy by měly nejen efektivně degradovat příslušné xenobiotikum, ale měly by především být schopné přežít v konkurenci ostatních členů dané populace. Projekt umožní sledovat i průběh horizontálního přenosu genů mezi organismy.
Navrhovaný projekt bude založen na postupném řešení několika fází. Nejdříve budou ze známých znečištěných lokalit odebrány vzorky kontaminovaného materiálu. V projektu se soustředíme na lokality a vzorky především půdy kontaminované halogenovanými látkami (půda na skládkách, kaly, sedimenty) jako jsou např. polychlorované bifenyly, polybromované difenylethery, pesticidy, polyaromatické uhlovodíky. Z odebraných vzorků budou izolovány nukleové kyseliny, molekuly genomové DNA a mRNA, z mRNA bude připravována cDNA. Tento genetický materiál bude následně sekvenčně analyzován na genomovém sekvenátoru v rozsahu odpovídajícím stovkám až tisícům bakteriálních genomů. Jako mezikrok budou z některých významnějších vzorků připravovány kosmidové klony a teprve tyto hromadně sekvenčně analyzovány. Nukleotidové sekvence jednotlivých vzorků prostředí budou porovnávány navzájem, jak z hlediska podobnosti kódujících sekvencí, tak jejich četnosti. Všechny generované sekvence, ale především ty, které budou vykazovat podobnost s geny, již popsanými jako geny kódující přislušné bioremediační enzymy nebo celé enzymové dráhy, budou vkládány do databází. Kromě analysy funkčních genů bude pozornost zaměřena i na zastoupení určitých taxonomických skupin a jejich změny. Všechny sekvence budou vyhodnocovány z několika hledisek. Klíčovými parametry budou především podobnost vybraných kódujících sekvencí, zastoupení určitých sekvencí v daném vzorku, časová, prostorová změna zastoupení sekvencí ve vzorcích, změny v závislosti na typu a množství kontaminujících látek, eventuálně i jejich produktů, konkrétních podmínkách v prostředí jako je redox potenciál, pH, osmotický tlak, finální akceptor elektronů atd., před a po provedení konkrétního bioremedičního postupu. Další aspekt, který bude v této souvislosti sledován je úloha rhizosférních bakterií, což jsou bakterie žijící na kořenech rostlin a vzájemné interakce mikrobiálních populací a příslušného rostlinného druhu, který jim umožňuje přežívat v kontaminovaném prostředí. V tomto uspořádání bude možné sledovat horizontální přenos zajímavých sekvencí a následné vlastnosti populace ovlivněné vnějšími podmínkami (přídavek induktorů, kořenové exudáty a jejich složky). Zavedení výše popsané metodiky bude základem pro zdokonalení dalších genetických postupů a to jsou metody TTGE a SIP, u kterých znalost sekvencí přítomných a funkčních mikroorganismů je nezbytná. Z obecnějšího hlediska výsledky projektu umožní navrhnout a ověřit postupy pro řešení dosud nezodpovězených otázek souvisejících s mikrobiální degradací xenobiotik, interakcemi, komunikací a kompeticí mikroorganismů v jakýchkoli podmínkách a prostředí. Sekvence významné z hlediska potenciálního biodegradačního katabolického účinku mohou být i základem pro přípravu geneticky modifikovaných mikroorganismů, které budou nejen schopné degradovat určité xenobiotikum, ale též schopné přežít v konkurenci dalších organismů příslušné komunity.
| Webmaster: jan dot paces at img dot cas dot cz Last modified: Tue Nov 11 21:14:20 CET 2008 |